Sekwencjonowanie - rewolucja w badaniach kwasów nukleinowych
- Czym jest sekwencjonowanie?
Sekwencjonowanie polega na ustaleniu kolejności cząsteczek chemicznych (par nukleotydów) w cząsteczce kwasu nukleinowego. Pozwala na poznanie genomów poszczególnych organizmów. Ze względu na wzrost zapotrzebowania na badania nad genomem następuje ciągły rozwój technik sekwencjonowania pozwalający na wykrywanie wszelkich zmian w materiale genetycznym.
Ryc. 1
- Sekwencjonowanie Sangera
Sekwencjonowanie metodą Sangera jest złotym standardem i jako rutynowa metoda wykorzystywana w diagnostyce pomimo swoich zalet, takich jak wysoka czułość reakcji, posiada wiele
ograniczeń. Jako pierwsza opracowana metoda wyróżniała się prostotą wykonania, łatwością automatyzacji i wykorzystaniem znakowania fluorescencyjnego. Metoda ta była powszechnie stosowana przy badaniach nad genomami ludzkimi ponieważ cechuje się wysoką wiarygodnością odczytywanych sekwencji DNA.
Ryc. 2 Przykładowy elektoforegram.
Największym ograniczeniem metody jest jednak brak możliwości multipleksowania próbek, co powoduje znaczne wydłużenie czasu i wzrost kosztów analizy.
- Sekwencjonowanie II generacji
Kolejnym krokiem w rozwoju technologii sekwencjonowania było opracowanie przez firmę Ilumina sekwenatora Solexa. Metodyka składała się z kilku etapów, zaczynając od: przygotowania biblioteki genomowej, formowania klastrów w komorze przepływowej, sekwencjonowania i dalszej analizy (porównania do sekwencji referencyjnej). Nowa technologia pozwoliła na znaczne ograniczenie wad, wynikających z metody rutynowej – nastąpiło skrócenie czasu analiz, przy jednoczesnym wzroście liczby analizowanych prób. Jednak ze względu na wysokie koszty całej analizy, kontynuowano badania w celu ich zoptymalizowania.
- Sekwencjonowanie III generacji Oxford Nanopore
Sekwencjonowanie nanoporowe to jedna z najnowszych technik sekwencjonowania III generacji. Wykorzystuje ona elektroforetyczny transport kwasów nukleinowych przez kanały białkowe – nanopory. Identyfikacja sekwencji działa na zasadzie zmian sygnału elektrycznego. Technika pozwoliła na spektakularne osiągnięcia w dziedzinie badań nad genomem tj. asemblacja genomów, wykrywanie modyfikacji kwasów nukleinowych i ich zmienności strukturalnej i alternatywnego składania transkryptów.
W porównaniu z pozostałymi metodami sekwencjonowanie naporowe wyróżnia się możliwością identyfikacji kwasów nukleinowych w natywnej formie. Znacząco upraszcza i przyspiesza to przygotowanie biblioteki sekwencyjnej. Reakcja nie wymaga również przeprowadzenia procesu amplifikacji. Eliminuje to ryzyko błędów takich jak wystąpienie zmian
sekwencji w badaniach ekspresji genów. Dodatkowym atutem sekwencjonowania nanoporowego jest brak ograniczeń co do długości odczytów. Długość sekwencji jest determinowana długością nici DNA. Krótki czas trwania analizy, niewielkie wymagania sprzętowe, sekwencjonowanie RNA , detekcja zmodyfikowanych
Ryc. 3
nukleotydów oraz możliwość przeprowadzania analizy wielu próbek jednoczasowo to tylko niektóre z zalet nowoczesnej technologii.
- Zastosowanie
|
|
Sanger |
Nanopore |
|
|
MIKROBIOLOGIA |
Identyfikacja mikroorganizmów |
Analiza z pojedynczej kolonii |
Analiza wielogatunkowa |
|
Badania środowiskowe |
Badanie pod kątem jednego patogenu |
Identyfikacja wielu patogenów w trakcie jedej analizy |
|
|
Czystość mikrobiologiczna w produkcji przemysłowej |
Badanie pod kątem jednego patogenu |
Identyfikacja skażeń mikrobiologicznych różnych gatunków bakterii, wirusów i grzybów |
|
|
Badanie mikrobioty |
Niemożliwe
|
Identyfikacja ogółu mikroorganizmów |
|
|
BADANIA GENOMOWE |
Analiza transkryptomu
|
Badania obarczone błędem składania odczytów |
Możliwośc odtworzenia całejk sekwencji transkryptu w pojedynczym transkrypcie |
|
Konieczność przepisania nici RNA na cDNA |
Możliwość sekwencjonowania cząsteczek RNA w natywnej formie |
||
|
Analiza modyfikacji chemicznych |
Niemożliwe |
Możliwość identyfikacji metylacji |
|
|
Analiza zmienności strukturalnej |
Ryzyko błędów |
Wykrywanie większej ilości zmian przy mniejszym pokryciu genomu, zmniejszenie ryzyka błędów |
|
Tab. 1
Źródła:
Ryc 1. https://sekwencjonowanie.com/pl/pomoc
Ryc. 2 G. Fusco et al. / MethodsX 2 (2015) 47–52
Ryc. 3 Opracowanie własne
Tab.1 Opracowanie własne