Sekwencjonowanie 0
Sekwencjonowanie

Sekwencjonowanie  - rewolucja w badaniach kwasów nukleinowych

 

  1. Czym jest sekwencjonowanie?

 

Sekwencjonowanie polega na ustaleniu kolejności cząsteczek chemicznych (par nukleotydów) w cząsteczce kwasu nukleinowego. Pozwala na poznanie genomów poszczególnych organizmów.  Ze względu na wzrost zapotrzebowania na badania nad genomem następuje ciągły rozwój technik sekwencjonowania pozwalający na wykrywanie wszelkich zmian w materiale genetycznym.

 

Ryc. 1

 

 

  1. Sekwencjonowanie Sangera

Sekwencjonowanie metodą Sangera jest złotym standardem i jako rutynowa metoda wykorzystywana w diagnostyce pomimo swoich zalet, takich jak wysoka czułość reakcji, posiada wiele
ograniczeń. Jako pierwsza opracowana metoda wyróżniała się prostotą wykonania, łatwością automatyzacji i wykorzystaniem znakowania fluorescencyjnego. Metoda ta była powszechnie stosowana przy badaniach nad genomami ludzkimi ponieważ cechuje się wysoką wiarygodnością odczytywanych sekwencji DNA.

 

Ryc. 2 Przykładowy elektoforegram.

 

Największym ograniczeniem metody jest jednak brak możliwości multipleksowania próbek, co powoduje znaczne wydłużenie czasu i wzrost kosztów analizy.

 

  1. Sekwencjonowanie II generacji

Kolejnym krokiem w rozwoju technologii sekwencjonowania było opracowanie przez firmę Ilumina sekwenatora Solexa. Metodyka składała się z kilku etapów, zaczynając od: przygotowania biblioteki genomowej, formowania klastrów w komorze przepływowej, sekwencjonowania i dalszej analizy (porównania do sekwencji referencyjnej). Nowa technologia pozwoliła na znaczne ograniczenie wad, wynikających z metody rutynowej – nastąpiło skrócenie czasu analiz, przy jednoczesnym wzroście liczby analizowanych prób. Jednak ze względu na wysokie koszty całej analizy, kontynuowano badania w celu ich  zoptymalizowania.

 

  1. Sekwencjonowanie III generacji Oxford Nanopore

Sekwencjonowanie nanoporowe to jedna z najnowszych technik sekwencjonowania III generacji. Wykorzystuje ona elektroforetyczny transport kwasów nukleinowych przez kanały białkowe – nanopory. Identyfikacja sekwencji działa na zasadzie zmian sygnału elektrycznego. Technika pozwoliła na spektakularne osiągnięcia w dziedzinie badań nad genomem tj. asemblacja genomów, wykrywanie modyfikacji kwasów nukleinowych i ich zmienności strukturalnej i alternatywnego składania transkryptów.

W porównaniu z pozostałymi metodami sekwencjonowanie naporowe wyróżnia się możliwością identyfikacji kwasów nukleinowych w natywnej formie. Znacząco upraszcza i przyspiesza to przygotowanie biblioteki sekwencyjnej. Reakcja nie wymaga również przeprowadzenia procesu amplifikacji. Eliminuje to ryzyko błędów takich jak wystąpienie zmian

 sekwencji w badaniach ekspresji genów. Dodatkowym atutem sekwencjonowania nanoporowego jest brak ograniczeń co do długości odczytów. Długość sekwencji jest determinowana długością nici DNA. Krótki czas trwania analizy, niewielkie wymagania sprzętowe, sekwencjonowanie RNA , detekcja zmodyfikowanych

Ryc. 3

 

nukleotydów oraz możliwość przeprowadzania analizy wielu próbek jednoczasowo to tylko niektóre z zalet nowoczesnej technologii.

 

  1. Zastosowanie

 

Sanger

Nanopore

MIKROBIOLOGIA

Identyfikacja mikroorganizmów

Analiza z pojedynczej kolonii

Analiza wielogatunkowa

Badania środowiskowe

Badanie pod kątem jednego patogenu

Identyfikacja wielu patogenów w trakcie jedej analizy

Czystość mikrobiologiczna w produkcji przemysłowej

Badanie pod kątem jednego patogenu

Identyfikacja skażeń mikrobiologicznych różnych gatunków bakterii, wirusów i grzybów

Badanie mikrobioty

Niemożliwe

 

Identyfikacja ogółu mikroorganizmów

BADANIA GENOMOWE                             

Analiza transkryptomu

 

Badania obarczone błędem składania odczytów

Możliwośc odtworzenia całejk sekwencji transkryptu w pojedynczym transkrypcie

Konieczność przepisania nici RNA na cDNA

Możliwość sekwencjonowania cząsteczek RNA w natywnej formie

Analiza modyfikacji chemicznych

Niemożliwe

Możliwość identyfikacji metylacji

Analiza zmienności strukturalnej

Ryzyko błędów

Wykrywanie większej ilości zmian przy mniejszym pokryciu genomu, zmniejszenie ryzyka błędów

  Tab. 1

 

 

 

Źródła:

Ryc 1. https://sekwencjonowanie.com/pl/pomoc

Ryc. 2 G. Fusco et al. / MethodsX 2 (2015) 47–52

Ryc. 3 Opracowanie własne

Tab.1 Opracowanie własne

Komentarze do wpisu (0)

do góry
Sklep jest w trybie podglądu
Pokaż pełną wersję strony
Sklep internetowy od home.pl